PRZYRZĄDY OPTYCZNE — MIKROSKOPY ŚWIETLNE I ELEKTRONOWE

Mikroskop świetlny

U podstawy konstrukcji mikroskopów świetlnych różnego typu legły dwa zasadnicze zjawiska, którym podlega promień światła: 1) załamanie i odbicie na granicy dwóch różnych środowisk, 2) dyfrakcja i interferencja światła. W mikroskopie świetlnym możemy oglądać organizmy lub tkanki utrwalane i barwione lub żywe, w świet1e przechodzącym przez nie. W tym celu każdy mikroskop jest wyposażony w dwie główne składowe: mechaniczną i optyczną. Pierwsza służy do manipulowania preparatem i przesuwania części optycznych wzglądem preparatu, druga — do oświetlenia preparatu i wytworzenia jego obrazu. Część mechaniczna składa się z ruchomego stolika umieszczonego pod obiektywami, którym precyzyjnie ustawiamy preparat wzglądem obiektywu, oraz z układu śrub do ustawiania w ogniskowej części optycznych. Część optyczna składa się z obiektywów, okularów i kondensora. Obiektywy wytwarzają obraz rzeczywisty i powiększony promieni świetlnych ugiętych na preparacie. Okulary powiększają obraz wytworzony przez obiektyw i jest to obraz pozorny i odwrócony. Oświetlacz ogniskuje światło lampy na płaszczyźnie preparatu, zapewniając równomierne oświetlenie pola widzenia.

Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i obiektywu
(w nowoczesnych mikroskopach należy jeszcze uwzględnić powiększenie pryzmatu, kierującego światło z obiektywów do okularów, który znajduje się w nasadce okularowej). Wartości powiększeń są umieszczone na obudowach części optycznych. Zdolność rozdzielcza mikroskopu zależy od długości fali świata oświetlającego preparat i jest do niej wprost proporcjonalna, a także od numerycznej apertury obiektywu (NA), do której jest odwrotnie proporcjonalna.

Wartość numerycznej apertury obiektywu jest umieszczona na obudowie obiektywu i wynosi, w zależności od powiększenia obiektywu, od 0,25 do 1,25 (specjalne i bardzo kosztowne obiektywy mają NA 1,6). Przeciętna zdolność rozdzielcza dla światła białego = 0,5 nm) i dla obiektywu o NA 1,25 wynosi 0,27 µm. Oznacza to, że dwa obiekty leżące obok siebie w odległości 0,27 µm można jeszcze dostrzec jako oddzielne. W przypadku mniejszej zdolności rozdzielczej obiekty te zostaną dostrzeżone jako jeden, nie zostaną rozdzielone. Do celów praktycznych można przyjąć, że zdolność rozdzielcza mikroskopu świetlnego ma mniej więcej wartość połowy długości fali światła, którym oświetlamy preparat.

Mikroskop kontrastowo-fazowy

W przyrodzie spotykamy się z przedmiotami amplitudowymi, które w różnym stopniu pochłaniając światło zmieniają amplitudę przechodzącego lub odbitego światła, a zatem posiadają kontrast naturalny, oraz przedmiotami fazowymi, które nie pochłaniają światła w sposób dostrzegalny, a jedynie zmieniają (opóźniają) jego fazę. Przedmioty fazowe mają różny od środowiska współczynnik załamania światła, który zależy od gęstości przedmiotu lub, albo również od jego grubości.

Oko ludzkie rozróżnia długość fali i natężenie światła widzialnego. W mikroskopie świetlnym oglądamy obrazy powstające dzięki modyfikacjom, którym ulega wiązka światła przechodząca przez preparat. Jedne z tych modyfikacji są rozróżniane przez nasze oko, inne nie. Łatwo rozróżniamy miejsca zawierające substancje przepuszczające określone części widma światła widzialnego – widzimy je jako barwne. Inne przezroczyste struktury komórkowe mogą być rozróżnialne dzięki temu, że silniej lub słabiej absorbują fale świetlne, tj. w mniejszym lub większym stopniu zmieniają natężenie światła, czyli amplitudę fali świetlnej.

Prędkość rozchodzenia światła, w różnych ośrodkach jest różna. Fala świetlna przechodząc przez obiekt może ulec opóźnieniu względem fali przechodzącej obok. Powstanie różnica faz – przesunięcie fazowe. W materiale biologicznym różnica faz między falami przechodzącymi przez obiekt i obok obiektu wynosi około ¼ długości fali. Oko ludzkie jednak nie rejestruje tego efektu, tzn. struktury małe, niewiele różniące się od siebie stopniem pochłaniania światła są w mikroskopie niewidoczne. Różnica ta może się stać widoczna, jeśli efekt fazowy zostanie zamieniony na amplitudowy. Tę zmianę uzyskuje się dzięki nałożeniu na siebie (interferencji) fali opóźnionej z nieopóźnioną.

W mikroskopie kontrastowo-fazowym przesunięcia fazy świetlnej przechodzącej przez obiekt uzyskuje się dzięki wyposażeniu mikroskopu w specjalną przysłonę w kondensorze oraz płytkę fazową w obiektywie. Pierścieniowa przesłona obecna w kondensorze umożliwia przechodzenie światła w postaci wydrążonego stożka, przy czym pozostała część światła zostaje pochłonięta. Stożek takiego światła ogniskuje się na preparacie. Płytka fazowa umieszczona jest z kolei w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu i jest to przezroczysta tarcza z wyżłobieniem (lub zgrubieniem) o takim kształcie i wielkości, że pokrywa się z bezpośrednim obrazem dodatkowej przesłony pierścieniowej kondensora. Jeśli pomiędzy kondensorem a obiektywem zostanie umieszczony preparat, to na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu pojawią się liczne, nakładające się obrazy dyfrakcyjne przesłony. Wyżłobienia (lub wypukłości) na płytce fazowej obiektywu są tak wykonane, że wiązki promieni tworzących bezpośredni obraz i obraz dyfrakcyjny, różniące się w przebiegu optycznym o ¼ długości fali świetlnej są na siebie nakładane. W tych warunkach niedostrzegalna dla oka różnica faz fali świetlnej zostaje przetworzona na dostrzegalną różnicę natężenia światła (amplitudy fali). W układzie optycznym o jasnym (dodatnim) kontraście fazowym dwie wiązki fal (przechodząca przez obiekt i obok obiektu) sumują się, dając rozjaśnienie obrazu, podczas gdy przy ciemnym (ujemnym) kontraście fazowym częściowo znoszą się one wzajemnie, tworząc ciemniejszy obraz o silniejszych kontrastach.

Mikroskop kontrastowo-fazowy umożliwia skontrastowanie niebarwionych preparatów i jest wykorzystywany głównie do obserwacji żywych komórek.

Mikroskop polaryzacyjny

Jest to mikroskop świetlny wyposażony w dwa układy polaryzujące: jeden (polaryzator) umieszczony w części oświetleniowej (przed kondensorem), drugi (analizator) - w części obserwacyjnej (w okularze). Polaryzator i analizator przepuszczają światło tylko w jednej płaszczyźnie. Jeśli płaszczyzny krzyżują się (ustawione względem siebie pod kątem 90^o) nie przepuszczają w ogóle światła, świecenie pojawi się, jeśli umieścimy na jego przebiegu (między polaryzatorem i analizatorem) obiekt, który skręci płaszczyznę polaryzacji światła. Obecnie do polaryzacji światła stosuje się polaroidy wykonane z cienkiej folii, w której znajdują się kryształki substancji organicznych uporządkowane w jednym kierunku.

Wiele naturalnych substancji ma właściwości izotropowe, tzn. światło przechodzi przez nie równie dobrze we wszystkich kierunkach, inne – anizotropowe, czyli dwójłomne – cechuje niejednakowy stopień przepuszczania światła. Dwójłomność przedmiotów niebiologicznych jest wynikiem krystalicznej ich budowy, substancji biologicznych – wskazuje na regularny układ cząsteczek (jak w krysztale – np. ziarna skrobi, sferokryształy inuliny, micelle celulozowe, itp.). Dwójłomność struktur komórkowych może też być wynikiem regularnego ułożenia drobnych cząstek różniących się od otaczającego środowiska współczynnikiem załamania światła (np. mikrotubule).

Mikroskop fluoroscencyjny

Zjawisko, w którym światło jest źródłem wtórnych efektów świetlnych nazywamy fotoluminescencją. Obejmuje ona dwie grupy zjawisk: fluorescencję i fosforescencję. Do pierwszej zaliczamy takie, które trwają dopóty, dopóki światło pobudza wtórne promieniowanie świetlne, do drugiej zaś takie, w których promieniowanie wtórne pozostaje po ustaniu działania promieni pobudzających (przedmioty fosforyzujące świecą w ciemności).

W mikroskopie fluorescencyjnym oświetlenie preparatu spełnia jedynie rolę dostawcy energii i nie bierze udziału w tworzeniu obrazu. Obraz jest widoczny dzięki własnemu promieniowaniu badanego obiektu, zdolnego do fluorescencji. Dla obserwacji zjawiska fluorescencji stosowane są źródła światła krótkofalowego (od UV do niebieskiego). Obecnie stosuje się lampy rtęciowe wysokociśnieniowe, które emitują intensywne światło w różnych zakresach widma, maksima przy: 356nm - UV, 405 nm - światło fioletowo- niebieskie i przy 434nm - światło niebieskie.

Światło pobudzające kierowane jest na obiekt za pomocą kondensora. Na drodze promieni ustawia się filtr wzbudzający, który eliminuje zbędne zakresy widma światła i pozwala na pracę w wybranym zakresie. W części obserwacyjnej musi być umieszczony filtr odcinający światło wzbudzające, które częściowo wchodzi do mikroskopu.

Istota metody fluorescencyjnej polega na zjawisku przekształcenia promieni pobudzającego światła wysokoenergetycznego (tj. nadfioletowego lub widzialnego – fioletowego czy niebieskiego), pochłoniętych przez niektóre związki chemiczne, na niżej energetyczne, o charakterystycznym dla danego związku zakresie długości fali. Struktury komórkowe zawierające taki związek, pod wpływem oświetlenia ich np. nadfioletem emitują typową dla niego barwę (świecące struktury na czarnym tle pola widzenia – filtr odcinający przepuszcza tylko światło wzbudzone).

Tylko nieliczne związki chemiczne zawarte w komórkach są zdolne do fluorescencji pierwotnej (autofluorescencji, np. chlorofil), w przypadku innych efekt fluorescencji może być uzyskany dzięki zastosowaniu fluorochromów. Fluorochromy to substancje mające zdolność do autofluorescencji, a dzięki ich powinowactwu do określonych związków obecnych w komórkach nadają im właściwości fluorescencji wtórnej (np. oranż akrydynowy, który tworzy specyficzne kompleksy z kwasami nukleinowymi). Metoda fluorescencji jest na tyle czuła, że pozwala na wykrycie i dokonanie ilościowego pomiaru bardzo niewielkich ilości substancji. Fluorochromami mogą być znakowane przeciwciała (immunofluorescencja) stosowane w cytochemii i diagnostyce klinicznej.

Mikroskop interferencyjny (Nomarskiego)

Jest to optycznie zmodyfikowany mikroskop świetlny, w którym do wytworzenia obrazu kontrastowego wykorzystuje się nakładanie się na siebie (interferencja) dwu lub kilku wiązek świetlnych, różniących się od siebie opóźnieniem w fazie. Ilościowe określenie stopnia opóźnienia w fazie wiązek świetlnych wzglądem siebie pozwala na zmierzenie suchej masy przedmiotu oglądanego - komórki albo, innymi słowy ,,zważenie” komórki. Opóźnienie w fazie wiązek świetlnych przechodzących przez przedmiot - komórkę jest wprost proporcjonalne do jej suchej masy.

Mikroskop konfokalny albo współogniskowy

Mikroskop konfokalny to mikroskop fluorescencyjny, gdzie źródłem światła jest laser lub kilka laserów (np. 4). Światło jest ogniskowane w jednym punkcie na określonej głębokości preparatu, a konstrukcja przesłony w detektorze sprawia, że w powstający obraz zostaje włączona tylko fluorescencja emitowana dokładnie z miejsca ogniskowania. Promień lasera określonej długości fali wybiera (skanuje) powierzchnię preparatu punkt po punkcie wzdłuż osi x i y. Powstały obraz jest pozbawiony struktur preparatu nieostrych i pozostających poza ogniskową obiektywu. Ponadto urządzenie sterujące pozwala dokonywać tzw. przekrojów optycznych preparatu. Promień lasera automatycznie skanuje stosunkowo gruby preparat (~50µm) na kolejnych, coraz głębszych płaszczyznach preparatu, zgodnie z życzeniem obserwatora, np. odstępach 0,5µm. Następnie program komputerowy składa serie obrazów w jeden trójwymiarowy obraz konfokalny (współogniskowy). Kilka źródeł promieniowania laserowego o dobranych długościach fali światła wzbudzającego może inicjować fluorescencję kilku typów fluorochromów, prezentując równocześnie wielobarwny preparatu.

Mikroskop elektronowy transmisyjny

Na początku XX wieku dokonano odkrycia, które wykazało, że strumień elektronów emitowany z rozżarzonego drutu wolframowego (katody) może się zachowywać jak fala fotonów: ulegać ugięciu na strukturach preparatu i poddawać się działaniu pola magnetycznego, ogniskując się, i tworzyć obraz ugiętych elektronów na strukturach preparatu. Zaletą zastosowania strumienia elektronów do formowaniu obrazów przedmiotu była ich krótka fala, która można było redukować przyspieszając bieg elektronów w próżni. Zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronowego jest większa niż mikroskopu świetlnego, ale i w tym przypadku ogranicza ją przede wszystkim długość fali. Długość fali elektronów, wykorzystywana do uzyskania powiększonego obrazu w mikroskopie elektronowym, jest proporcjonalna do pierwiastka z napięcia przyspieszającego elektrony w polu elektrycznym. Mikroskop elektronowy pracujący przy napiciu 100 kV rozpędza strumień elektronów do prędkości 164 354 km na sekundą. Przy tak dużej prędkości fala elektronów ma 0,04 Ä (4x 10^-12 m) długości, a zatem zdolność rozdzielcza jest 67 500 razy lepsza od uzyskanej w mikroskopie świetlnym. W praktyce teoretyczna zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronie jest jednak nigdy osiągalna z różnych przyczyn: 1) niedoskonałości konstrukcyjnych samego mikroskopu i 2) właściwości preparatów biologicznych. Praktyczna zdolność rozdzielcza wymagana od średniej klasy mikroskopu elektronowego do badań cytologicznych powinna wynosić 1 nm (1x10^-9m). Zapewnia ona uzyskiwanie dużych i czytelnych powiększeń od 10 000 do 40 000 razy.

Jak pracuje mikroskop elektronowy?

Strumień elektronów jest emitowany z rozżarzonej katody (drut wolframowy) i przyspieszany różnicą potencjałów (60 do 100kV) między katodą i anodą i przechodzi przez otwór tej ostatniej. Następnie rozpędzony strumień elektronów jest ogniskowany na powierzchni preparatu, dzięki polu elektromagnetycznemu, które jest generowane przez dwie soczewki
elektromagnetyczne kondensorowe. Elektrony ulegają ugięciu na strukturach preparatu i elektromagnetyczna soczewka obiektywowa wytwarza obraz ugiętych elektronów, który zostaje powiększony przez dwie kolejne soczewki projekcyjne. Obraz preparatu zostaje wytworzony na ekranie fluorescencyjnym albo na kliszy fotograficznej lub też jest przekazany do kamery telewizyjnej. Naświetloną kliszę poddaje się obróbce fotograficznej i uzyskuje odbitki nazywane elektronogramami. We wnętrzu mikroskopu musi panować próżnia, aby atomy składników powietrza nie zakłócały przebiegu elektronów emitowanych przez katodę.

Istotna różnica pomiędzy mikroskopem świetlnym i elektronowym polega na tym, że w mikroskopie świetlnym obraz powstaje w wyniku absorpcji fotonów na elementach preparatu, natomiast w mikroskopie elektronowym - wskutek ugięcia elektronów na strukturach preparatu. Stopień ugięcia elektronów zależy od masy cząsteczkowej tych struktur. Im większa masa cząsteczkowa, tym większa ilość elektronów zostaje ugięta i nie wchodzi do otworu apertury obiektywu (średnica 20 µm) - tym samym nie rozświetla ekranu lub nie naświetla kliszy. Elektrony nie ugięte na strukturach przechodzą przez preparat i wzbudzają ekran do świecenia. Powstały obraz jest, zatem mozaiką naświetlonych i nienaświetlonych obszarów ekranu tub kliszy
fotograficznej. Pierwiastki, które wchodzą w skład preparatów biologicznych, należą do lekkich, np. Na, K, C, P S. W celu uzyskania dobrego kontrastu obrazu musimy preparaty biologiczne traktować solarni metali ciężkich, np. Os, Pb, U. Sole metali, którymi ,,barwimy” komórki, adsorbują się wybiórczo na niektórych substancjach komórkowych, takich jak lipidy, glikogen lub kwasy nukleinowe. Elektrony uginają się na atomach metali ciężkich i w efekcie powstaje kontrastowy obraz komórki.

Z opisanej skrótowo powyżej zasady działania mikroskopu elektronowego transmisyjnego wynika, że obraz można uzyskać po odpowiednim przygotowaniu preparatu. W przeciwieństwie do mikroskopu świetlnego w mikroskopie elektronowym można oglądać jedynie preparaty z komórek utrwalonych. Najczęściej obecnie stosowanym utrwalaczem jest roztwór aldehydu glutarowego (w buforze o określonym pH i stężeniu), po czym dodatkowo utrwala się czterotlenkiem osmu (OsO₄). Ze względu na małą przenikliwość elektronów skrawki muszą być bardzo cienkie – nie grubsze niż 0,05mm (50µm). Przygotowanie takich skrawków wymaga złożonej procedury przygotowawczej i odpowiednio precyzyjnego aparatu do krojenia – ultramikrotomu. Niewielkie fragmenty materiału (zazwyczaj nie większe niż 1 mm³) po utrwaleniu muszą być usztywnione, poddaje się je procedurze przesycania polimerami akrylowymi (metakrylany) lub epoksydowymi (epon). Po spolimeryzowaniu utwardzone w ten sposób tkanki są krojone na ultramikrotomie używając noży diamentowych lub szklanych (przełomy specjalnego szkła). Skrawki umieszczone na błonach nośnych na siateczkach podtrzymujących przed oglądaniem dodatkowo kontrastuje się związkami metali ciężkich: ołowiu i uranu. Metale te adsorbowane selektywnie na niektórych strukturach komórkowych zwiększają czytelność obrazu - są to ciemniejsze miejsca na ekranie lub elektronogramie.

Mikroskop elektronowy skaningowy

Zasada działania mikroskopu skaningowego różni się w kilku punktach od opisanego wyżej mikroskopu transmisyjnego. Podstawowe rozwiązania dotyczące emisji elektronów i ogniskowania strumienia są w zasadzie podobne. Różnice polegają na innym sposobie tworzenia obrazu preparatu.

W mikroskopie elektronowym skaningowym oglądamy obraz powierzchni preparatu. Wiązka elektronów wybiera (skanuje) pole powierzchni preparatu wzdłuż osi x i y. Elektrony pierwotne emitowane z katody bombardują powierzchnię preparatu wchodząc w interakcję z atomami jej struktur i wybijają z ich powłok elektrony wtórne. Ilość emitowanych elektronów wtórnych zależy od konfiguracji powierzchni preparatu. Części wypukłe emitują dużo elektronów (mocny sygnał), natomiast części wklęsłe mało (słaby sygnał). Elektrony wtórne są następnie wychwytywane przez detektor, wzmacniane i podawane jako sygnał elektryczny do siatki sterującej w lampie kineskopowej telewizora, gdzie jest formowany obraz, który zależy od różnicy mocy sygnałów. Cale urządzenie, podobnie jak mikroskop transmisyjny, działa w próżni.

Przyrządy pomocnicze dla mikroskopów

Mikrotomy

Służą do krojenia tkanek na cienkie skrawki, grubości 2-30µm, utrwalonych i utwardzonych parafiną tub żywicami, np. epoksydowymi. Skrawki można następnie wybarwiać barwnikami histologicznymi, które różnicują barwnie różne elementy komórki. Obok barwienia histologicznego można stosować skrawkach inne zabiegi różnicujące, np. barwienie histochemiczne tub immunohistochemiczne.

Mikrotom mrożeniowy

Niektóre składniki komórki nie wytrzymują utrwalania i drastycznych zabiegów histologicznych, wówczas w celu ich wykrycia należy zamrażać, np. w ciekłym azocie (LN), i następnie tkankę w stanie zamrożonym skrawać na cienkie skrawki. Mikrotomy mrożeniowe są wyposażone w specjalne agregaty chłodnicze, zdolne obniżyć temperaturę noża i komory chłodniczej n do -40⁰C.

Ultramikrotomy

Obserwacje komórek i tkanek w mikroskopie elektronowy transmisyjnym, ze względu na małą przenikliwość elektronów, wymagają bardzo cienkich skrawków. Warunki te wymusiły na konstruktorach zaprojektowanie niezwykle precyzyjnego układu mechanicznego tub termicznego, kontrolującego przesuw bloczka z badaną tkanką względem nieruchomego noża. Ultramikrotomy mogą osiągać dokładność krojenia rzędu 10 nm (10x 10^-9m). Do krojenia używa się bardzo twardych noży szklanych tub diamentowych. Znane są również ultramikrotomy mrożeniowe, za pomocą których można kroić tkanki w temperaturze -100⁰C. Są one używane do badań ultraimmunohistochemicznych.

Aparat Balcersa

Służy do rozłupywania tkanek zamrożonych w ciekłym azocie (LN), a następnie do wykonywania replik z ich odkrytej powierzchni. Technika ta, nazwana kriorytowniczą (ang. freeze fracture), umożliwia obserwacje struktur komórkowych w mikroskopie elektronowym transmisyjnym, z pominięciem utrwalania i utwardzania w żywicach. Jakkolwiek technika kriorytownicza nie jest wolna od rozmaitych artefaktów, pozwala jednak na weryfikację obrazów komórek uzyskanych dzięki konwencjonalnej metodzie opartej na skrawaniu tkanki utrwalonej i utwardzonej w żywicach. Technika kriorytownicza polega na zamrożeniu tkanki w LN, a następnie na złamaniu tej tkanki w komorze próżniowej aparatu. Zamrożone komórki pękają zazwyczaj w miejscach, gdzie znajdują się najsłabsze wiązania miedzy cząsteczkami (wiązania typu van der Waalsa). Odsłoniętą w procesie, rozłupaną powierzchnię tkanki napyla się węglem i platyną. Po napyleniu wyjmuje się tkankę z aparatu i poddaje trawieniu, np. mocnymi kwasami mineralnymi tub podchlorynami (Chlorox). Po całkowitym strawieniu tkanek zbiera się ich repliki na siateczki podstawne i ogląda mikroskopie elektronowym.

Aparat Anderssona

Podstawowym przyrządem do przygotowania tkanek tub komórek do obserwacji w mikroskopie elektronowym skaningowym jest aparat Anderssona. Obserwacja preparatów w mikroskopie elektronowym skaningowym, jak zresztą również w mikroskopie transmisyjnym, wymaga zachowania wysokiej próżni w komorze, w której umieszczony jest preparat. Tkanka musi być, zatem dokładnie wysuszona. Suszenie tkanek i komórek na wolnym powietrzu powoduje znaczną ich deformację i pękanie, wywołane wysokim napięciem powierzchniowym powstającym pomiędzy fazami wody i powietrza. W aparacie Anderssona suszenie odbywa się pod dużym ciśnieniem, w atmosferze dwutlenku węgla stanie krytycznym. Stan krytyczny gazu wyklucza powstawanie napięcia powierzchniowego pomiędzy preparatem a gazem, zapobiegając tym samym deformacji powierzchni komórek. W celu zakończenia procesu przygotowania preparatu do obserwacji w mikroskopie elektronowym skaningowym należy wysuszony preparat napylić metalami ciężkimi, np. zlotem, palladem lub platyną. Służą do tego napylarki próżniowe lub jonowe.

Napylarka próżniowa

Pod szklaną czaszą napylarki umieszczone są dwie pary elektrod, do których zostaje podłączony odpowiednio wyprofilowany, trudno topliwy drut wolframowy. Na tym drucie mocuje się drut złoty tub ze stopu platyny i palladu, którym należy napylić preparat. Po wytworzeniu pod czaszą odpowiedniej próżni (>5x 10 tora) do elektrod zostaje doprowadzony prąd (50A), co powodu rozgrzanie drutu wolframowego i topienie się drutu nawiniętego na nim, np. złotego. W próżni złoto paruje i pokrywa cienką warstewką powierzchnię preparatu, który uprzednio został umieszczony pod elektrodami. Po tych zabiegach preparat jest gotowy do obserwacji w mikroskopie elektronowym skaningowym. Cienka warstewka złota odprowadza ładunki elektryczne z powierzchni preparatu do masy (uziemia preparat), ale przede wszystkim jest źródłem elektronów wtórnych, które pośrednio tworzą obraz powierzchni preparatu.